本研究开发了全新的神经肽sNPF的探针GRAB_sNPF1.0，首次在活体动物中探究了同一群神经元释放sNPF和ACh在空间和时间上的特征，并筛选到选择性调控sNPF释放的Syt7和Sytα。这一新型的神经肽荧光探针有能力检测活体动物中内源神经肽的动态变化，无疑将帮助人们进一步研究神经肽的复杂调控功能。此外，神经肽与小分子神经递质共同传递在体内动态变化以及分子机制的研究，对于理解神经系统如何利用神经肽和小分子神经递质共同调控复杂功能具有重大意义。

图1. 同一群神经元共同释放神经肽和小分子神经递质的动态和分子调控机制模式图

神经传递是大脑信息交流的基础，其过程主要依赖于两种类型的囊泡：含有神经肽的大致密核心囊泡（Large dense core vesicle，LDCV）和含有小分子神经递质的突触小囊泡（Synaptic vesicle，SV）。传统的观念曾认为一个神经元只传递一种神经递质，但后续的研究颠覆了这一认知，研究发现，单个神经元可以传递多种神经递质，即共同传递（Co-transmission）现象。其有趣的是，无论是脊椎动物还是非脊椎动物，神经肽和小分子的共同传递是更为普遍的一种形式。这种共同传递在空间和时间维度上为神经系统调控赋予了更大的鲁棒性和易调性，在睡眠、昼夜节律、学习和记忆等生理功能以及诸多病理过程中起到至关重要的调节作用。深入剖析神经肽和小分子神经递质的共同传递机制，不仅能为我们揭开大脑信息编码方式的神秘面纱，更能帮助我们全方位、深层次地洞察大脑的运作奥秘。

然而，在以往的研究中，研究者更多地将目光聚焦于小分子神经递质的释放，对于同一神经元共同释放神经肽和小分子神经递质的时空动态以及分子机制知之甚少。

图2. 本研究关注的科学问题

2025年1月18号，威尼斯wnsr666、IDG麦戈文脑科学研究所、北大-清华生命联合中心李毓龙课题组，在《Nature Communications》杂志上发表了题为“A high-performance GRAB sensor reveals differences in the dynamics and molecular regulation between neuropeptide and neurotransmitter release”的研究论文，该研究成功开发了首个用于检测果蝇神经肽--短神经肽F（short neuropeptide F, sNPF）的探针GRAB_sNPF1.0，并巧妙结合已发表的乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）探针GRAB_ACh3.0(简称ACh3.0)，借助活体成像与光遗传技术等前沿手段，深入探究了活体动物中同一群神经元释放神经肽和小分子神经递质在时空动态上的差异，以及背后复杂的分子调控机制。

研究人员将目光锁定在果蝇的嗅觉学习中枢，蘑菇体肯亚神经元（Kenyon cell，KC）上。这群神经元在释放乙酰胆碱（ACh）的同时高表达短神经肽F（sNPF），为深入探究神经肽和小分子神经递质的共同传递提供了一个绝佳的平台。此前，李毓龙团队凭借基于GRAB探针策略（GPCR-Activation Based Sensor）成功开发了针对ACh的荧光探针ACh3.0，这为后续的深入研究奠定了坚实的技术基础。因此，研究人员首先基于GRAB探针策略开发了第一代绿色的sNPF探针GRAB_sNPF1.0，该探针在培养的细胞中展现出卓越的细胞膜定位能力，能够迅速响应外源sNPF，且具有极高的分子特异性，对细胞的正常生理活动无明显干扰。借助这一新型探针工具，研究人员在活体果蝇的蘑菇体KC神经元的水平叶区域成功检测到高钾溶液、光遗传以及气味等刺激引发的sNPF信号的上升，这标志着在活体动物中实时监测神经肽动态变化迈出了关键一步。

图3. GRAB_sNPF1.0可以特异性地检测内源神经肽sNPF的动态

为了进一步研究同一群神经元释放神经肽和小分子神经递质的共同传递。研究人员结合已发表的ACh3.0，研究了KC神经元释放sNPF和ACh的时空动态和分子机制。有趣的是，与ACh相比，sNPF在空间上的释放范围更广，存在胞体释放的形式；在时间维度上，sNPF的释放和衰退均慢于ACh。在短时间的刺激过程中，无论是连续还是间隔时间的刺激，sNPF呈现出增强型的释放模式，而ACh则呈现抑制型的释放模式。在较长时间的刺激过程中，sNPF能够维持在较高水平的释放，而ACh的释放会逐渐消失，但在一定时间内又能恢复。这一系列发现揭示了神经肽与小分子神经递质在释放过程中的显著差异，为理解神经传递的复杂调控机制提供了关键线索，也暗示着两者存在不同的分子调控机制。

图4. sNPF与ACh具有不同的释放模式

因此，研究人员进一步探究神经肽和小分子神经递质的分子调控机制，结果显示，首先，ACh和sNPF的释放均依赖于囊泡相关膜蛋白（Neuronal synaptobrevin，nSyb）。其次，本论文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对突触传递过程中的关键调控因子突触结合蛋白家族基因（Synaptotagmin，Syt）进行了遗传筛选。筛选结果显示，Syt7和Sytα能够选择性地调控KC神经元中sNPF的释放，却对ACh的释放无调控作用；而Syt1主要参与调控ACh的释放，对sNPF的释放不产生影响，其他Syt基因未表现出参与调控sNPF或者ACh释放的表型。这一发现精准锁定了调控神经肽释放的关键基因，为深入解析神经元共同传递的分子机制提供了有力抓手。

图5. sNPF和ACh的释放受到不同Syt所调控

威尼斯wnsr666教授李毓龙为该论文通讯作者；威尼斯wnsr666前沿交叉学科研究院PTN项目博士生夏西聚为第一作者，该团队其他成员为本研究提供了非常宝贵的建议。研究得到了威尼斯wnsr666膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家自然科学基金、北京市科委、生命医学峰基金、宋晨枫与高欣欣公益基金会和新基石科学基金会所设立的新基石研究员项目与科学探索奖等机构和经费的大力支持。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-56129-w

李毓龙实验室的更多相关工作详见：http://yulonglilab.org/。此外，实验室长期诚聘不同学科背景的副研究员、博士后及技术员，待遇从优。欢迎对脑科学感兴趣的有志青年加入！邮箱：yulongli@pku.edu.cn