为了在瞬息万变的自然界中获得尽可能多的生存、繁衍机会，动物进化出了关联学习记忆的能力——将中性的条件刺激（conditioned stimulus，CS），与惩罚性或奖赏性的非条件刺激（unconditioned stimulus，US）关联起来——从而实现趋利避害的本能。

最经典的关联学习记忆范式莫过于俄国科学家伊万·巴甫洛夫（Ivan Pavlov；1904年诺奖得主）对狗进行的“铃声-食物”关联学习训练。巴甫洛夫发现经过“铃声-食物”关联训练的狗听到铃声即可预判食物的到来，从而提前分泌唾液。在他的学术著作《条件反射》一书中，巴甫洛夫写道：“A ... most essential requisite for ... a new conditioned reflex lies in a coincidence in time of ... the neutral stimulus with ... the unconditioned stimulus.” 他敏锐地注意到“时间”对于训练效果的重要性：如果铃声响起一个小时后放饭，狗不能学会两者之间的联系；只有当铃声和食物同时出现，狗才能够学会二者之间的关联。在真实情况中，铃声和食物之间并不是分秒不差地同时出现，而是有一定的时间间隔，研究者把能够有效关联CS和US的最大时间间隔称为“一致性时间窗口（coincidence time window）”。虽然巴甫洛夫首次观察并且记录下了这一现象，但是他并不清楚隐藏在其背后的生物学机理。

在巴甫洛夫首次记录“一致性时间窗口”之后的一百年中，科学家相继在人、海兔、果蝇、蜜蜂等不同物种的学习行为中观察到了类似现象，时间范围从几秒钟到一分钟不等。此外，临床研究发现，一些神经发育不良、神经损伤或者神经退行性疾病患者表现出时间认知障碍，在巴甫洛夫式学习记忆测试中“一致性时间窗口”出现缩短或者延长的异常情况。异常缩短的时间窗口会导致动物难以学会事物之间正常的关联；反之，异常延长的时间窗口会导致动物把原本不相关的事件联系在一起。

尽管有如此多跨物种、跨疾病的现象描述以及相关性实验，但针对“一致性时间窗口”本身，仍有众多未解之谜：如1）时间窗口长度是否可调？2）它是否影响学习记忆后突触的可塑性变化？3）它受到什么神经环路和分子机理的调控？

2023年1月26日，威尼斯wnsr666/深圳湾实验室李毓龙团队在《神经元》（Neuron）期刊在线发表了题为“Local 5-HT signaling bi-directionally regulates the coincidence time window for associative learning”的研究成果，以经典的果蝇嗅觉学习记忆为范式，结合李毓龙验室开发的多种神经递质荧光探针，发现五羟色胺双向调节学习记忆的“一致性时间窗口”的新机理，并进一步解析了五羟色胺对突触可塑性的调节，及其发挥功能的负反馈神经环路。

在果蝇嗅觉学习记忆范式中，果蝇在“气味-电击”训练后会对特定气味形成恐惧记忆。早在1985年Tim Tully和William Quinn等人就已经发现，随着“气味”和“电击”的时间间隔增加，果蝇的学习效果逐渐变差。在此次研究中，团队成员利用T-迷宫装置复现了这个经典实验，通过系统性地改变时间间隔，测得果蝇的“一致性时间窗口”为16.9 s。当通过遗传学手段降低五羟色胺水平时，对应“一致性时间窗口”缩短。与之相反，通过抗抑郁药增加五羟色胺水平时，能够相应地延长时间窗口。由此，研究人员发现“一致性时间窗口”的长短并非固定不变，而是大脑中一个能够被五羟色胺水平双向调节的动态变量。

学习记忆的本质是突触可塑性变化，经典的电生理研究表明嗅觉学习记忆形成伴随着蘑菇体（mushroom body，果蝇的嗅觉学习记忆中枢）中KC（Kenyon Cell）和MBON（mushroom body output neuron）之间的突触抑制（synaptic depression）现象。团队成员利用该实验室开发的乙酰胆碱探针复现了这一研究结果，在此基础上发现“气味-电击”的时间间隔延长会导致可塑性变化消失，测量得到的“一致性时间窗口”为14.8 s，与行为学上16.9 s的数据极为相近。更重要的是，人为降低或者升高五羟色胺水平同样能改变时间窗口的长短，表明五羟色胺是通过调节突触可塑性，从而最终影响了学习行为。

在果蝇的大脑中，每个半球有且仅有一颗五羟色胺能DPM（dorsal paired medial）神经元投射到蘑菇体。团队成员系统地解析了DPM的上下游神经环路，发现KC释放的乙酰胆碱激活DPM，而DPM释放的五羟色胺对KC起到负反馈抑制作用。利用实验室开发的五羟色胺探针，该论文发现DPM在蘑菇体不同功能区的五羟色胺释放量并不均匀，而是呈现出空间特异性，五羟色胺局部水平差异赋予蘑菇体功能区不同的时间窗口。

图：五羟色胺能DPM神经元在蘑菇体中形成负反馈抑制神经环路，在突触可塑性和嗅觉学习记忆两个层面调节“一致性时间窗口”。

（图源：J. Zeng, et al., Neuron, 2023）

经典的赫布理论（Hebb’s rule）将突触的可塑性变化解释为“Cells that fire together, wire together”。1997~1998年，这一理论被一系列经典的电生理实验证明，并进一步完善为脉冲时序依赖可塑性（STDP, Spike-timing-dependent plasticity）——突触前、突触后神经元同时兴奋会产生“资格痕迹（eligibility trace）”，使突触处于能够被改变、但尚未发生改变的状态，等待着第三个元素出现；第三个元素是由神经调制介导的惩罚或者奖励信号，它的出现最终决定突触可塑性变化的方向和幅度。但是这一理论并不完美，因为不清楚等待时间长短由什么元素决定。曾有科学家推论五羟色胺很有可能发挥了这一功能，此次研究通过实验证实了这一猜想，表明五羟色胺是赫布理论中被遗漏的“时间调节因子”。

这项工作围绕巴甫洛夫学习记忆范式中重要的“时间一致性”问题，发现了一个完整的神经环路模型，揭示了神经递质五羟色胺调节“时间一致性”的特殊角色，动物利用这一计时机制来判断不同事件之间的因果关系。该研究有助于理解神经疾病导致学习记忆障碍的病理机制，为药物干预患者的时间认知障碍提供新的见解。

威尼斯wnsr666教授/深圳湾实验室分子生理学研究所合作研究员李毓龙、北大-清华生命科学联合中心2021届博士毕业生/深圳湾实验室分子生理学研究所博士后曾健智为共同通讯作者，曾健智博士和威尼斯wnsr666博士研究生李雪霖为共同第一作者，张任子墨、吕明月博士、王艺潘、谭柯、夏西聚、万金霞博士、张修宁、李瑜等对文章做了重要贡献。该工作得到了北京脑科学与类脑研究中心井淼团队、中科院生物物理所李岩团队（杨扬）、中科院深圳先进技术研究院储军团队（王亮）的通力合作。研究的支持来自威尼斯wnsr666膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、深圳湾实验室、国家自然科学基金、北京市科委、峰基金、Clement & Xinxin Foundation和中国博士后科学基金。

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